Don Carlo, Infant von Spanien, denkt wehmütig an die Zeit in Frankreich zurück, die er mit seiner Verlobten Elisabetta verbrachte. Aus politischen Gründen musste sie eine Heirat mit seinem Vater, König Philipp II., eingehen. Rodrigo, Marquis von Posa, kehrt aus Flandern zurück und möchte Carlo für die dortige Freiheitsbewegung gewinnen. Carlo vertraut Rodrigo an, dass er Elisabetta immer noch liebt. Die beiden schwören einander ewige Freundschaft.
Rodrigo bittet für Carlo um eine Audienz bei der Königin. Unter vier Augen kann Carlo seine Gefühle nicht zurückhalten, Elisabetta versucht ihn zur Besinnung zu bringen. Kurz darauf trifft König Philipp seine Gattin ohne höfisches Gefolge an. Er zieht den Marquis von Posa in sein Vertrauen und bittet ihn, seinen Sohn zu überwachen. Zudem warnt er ihn, der allzu offen über die Zustände in Flandern berichtet, vor den Gefahren der Inquisition.
Bei einem nächtlichen Treffen findet Carlo nicht wie erhofft Elisabetta, sondern die maskierte Prinzessin Eboli vor. Auch sie liebt Carlo, erfährt durch die Verwechslung jedoch von seiner ver- botenen Liebe und schwört Rache. Rodrigo überzeugt Carlo, ihm alle kompromittierenden Papiere zu übergeben.
Vor der großen Zeremonie des Autodafés, in der die Opfer der Inquisition öffentlich vorgeführt werden, stellt sich Carlo dem König, seinem Vater, mit den flandrischen Deputierten entgegen. Die Auseinandersetzung spitzt sich zu, bis schließlich Rodrigo Carlo entwaffnet und daraufhin in den Herzogsstand erhoben wird.
Das Misstrauen Philipps gegenüber Elisabetta und Carlo wird durch Prinzessin Eboli weiter geschürt. Auch der Großinquisitor hält ihn zu Härte gegen seinen aufrührerischen Sohn an, fordert jedoch auch den Tod des Marquis von Posa. Der König scheint machtlos wider den Einfluss der Kirche. Nachdem Rodrigo, seinem Freund treugeblieben, jeglichen gegen Carlo bestehenden Verdacht auf sich selbst lenkt, wendet sich das Blatt und sein Schicksal wird besiegelt. Carlo ist entschlossen, nach Flandern zu gehen.
Im Kloster San Yuste findet ein letztes Zusammentreffen von Carlo mit Elisabetta statt. Als die beiden durch den König und den Großinquisitor überrascht werden, rettet ein geheimnisvoller Mönch, der an den im Kloster beigesetzten Karl V. erinnert, Carlo vor seiner Verurteilung.
Ende der Vorstellung ca. 23:15 (Dauer 1. Teil. 1:20; Pause 25 Minuten; Dauer 2. Teil 1:15)