Don Carlo, Infant von Spanien, liebt Königin Elisabetta, die einst ihm versprochen war, aber aus politischen Gründen eine Heirat mit seinem Vater, König Philipp II., einging. Sein Freund Rodrigo, Marquis von Posa, kennt Carlos' Kummer und möchte ihn für die Freiheitsbewegung im unterdrückten Flandern gewinnen. Doch auch König Philipp vertraut sich dem Marquis an: Er bittet ihn um Beobachtung seines Sohnes und der Königin und warnt ihn vor den Gefahren der Inquisition.  

Bei einem nächtlichen Treffen findet Carlo nicht wie erhofft Elisabetta, sondern Prinzessin Eboli vor. Auch sie liebt Carlo, erfährt dadurch jedoch von seiner Liebe zur Königin und schwört Rache.  

Vor der Zeremonie des Autodafés, in der die Opfer der Inquisition vorgeführt werden, fordern flandrische Deputierte mehr Freiheiten. Carlo stellt sich ihnen voran und seinem Vater entgegen und wird schließlich von Rodrigo entwaffnet. König Philipp plagen Misstrauen und Zweifel, doch das Urteil der Kirche steht fest: Der Großinquisitor bestätigt ihn in der Härte gegenüber dem aufrührerischen Sohn, fordert aber auch den Tod des liberalen Marquis von Posa.

Carlo ist entschlossen, nach Flandern zu gehen. Bei seinem letzten Treffen mit Elisabetta werden die beiden durch den König und den Großinquisitor überrascht. Da erscheint ein geheimnisvoller Mönch, der Carlo vor den irdischen Gerichten rettet.